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如何测定土壤酶活,蔗糖酶,磷酸酶,过氧化氢酶,脲酶

最近一个月都在贵阳这边的一个烟草研究院测土壤酶活,大约测了一千多个土样吧。干了这么久也总结出一些经验。

  1. 多人操作,同时开工,流水作业
  2. 编号规范,最好用纯数字标记然后在Excel上做记录
  3. 在Excel中用VBA批量处理来自酶标仪的数据
  4. 使用专门的土壤酶活试剂盒,减少配试剂浪费的时间

下面这段代码是用来处理酶标仪数据的,大概用处就是识别酶标仪测出的Excel文件里面有数据的格子然后按一定格式排列,大家可以拿来做个模板。如何使用Excel自带的VBA就不需要我多讲了吧,自行搜索“Excel+VBA”即可。

下面是引用的测酶活的各种方法,由于我们用试剂盒,自己配试剂的情况只出现了一次。

土壤酶活性测定方法

一、蔗糖酶: 3,5-二硝基水杨酸比色法

  1. 试剂配制
    • 2N氢氧化钠200mL:称取16g 氢氧化钠,用蒸馏水溶解,定溶于200mL容量瓶中。
    • 3,5-二硝基水杨酸溶液 1000mL:称5g二硝基水杨酸,溶于200mL2N氢氧化钠和500mL蒸馏水中,再加300g酒石酸钾钠,用蒸馏水稀释至1000mL(不超过7天)。
    • 1/15M 磷酸氢二钠1000mL:867g Na2HPO4·12H2O溶于1000mL蒸馏水中。
    • 1/15M 磷酸二氢钾1000mL:078g KH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。
    • 5磷酸缓冲液100mL:5 mL磷酸氢二钠(1/15M)加95mL磷酸二氢钾(1/15M)
    • 8%蔗糖1000mL:称取80g蔗糖,用水溶解,稀释至1000mL。
    • 甲苯。
    • 标准葡萄糖溶液(1mg/mL)1000mL: 取少量葡萄糖在真空干燥箱中,于55℃条件下真空干燥至恒重。然后取00g葡萄糖溶于100ml蒸馏水中成标准葡萄糖母液(10mg还原糖/ml)。取此母液10ml, 用蒸馏水定容至100mL即成标准葡萄糖液(1mg/ml);
  1. 操作步骤

(1)标准曲线绘制:分别取标准葡萄糖液 0.4mL,0.8 mL,1.2mL, 1.6mL, 2.0mL,2.8mL, 3.2mL于50 mL比色管中,另取一管做空白对照。用蒸馏水补足至10mL。加入3.0mL 3,5-二硝基水杨酸,沸水浴5min,随即在自来水流下冷却。最后用蒸馏水稀释至50mL,并在分光光度计上于波长508nm处进行比色。

比色后,以光密度值为纵坐标,葡萄糖浓度为横坐标绘制成标准曲线。

(2)土壤蔗糖酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,注入15.0mL 8%蔗糖溶液,5.0mL pH5.5磷酸缓冲液和5滴甲苯。摇匀混合物后,放入恒温箱,在37℃下培养24h。到时取出,6000rpm离心10min。取1.0mL上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为1.0mL;风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL)于50mL比色管中,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

为消除土壤中原有的蔗糖、葡萄糖引起的误差。每一土样需做无基质对照。整个实验需作无土壤对照。

3.结果计算

蔗糖酶活性以24h后1g土壤葡萄糖的毫克数表示。

葡萄糖(mg)=(a-b)×c

式中 a—从标准曲线查得的样品(加了基质)对应的葡萄糖浓度,mg/mL;

b—从标准曲线查得的样品对照组的葡萄糖浓度,mg/mL;

c—换算成1g土的系数。

二、脲酶: 靛酚比色法

  1. 试剂配制
  • 7柠檬酸盐缓冲液1L:取184g柠檬酸溶于300mL蒸馏水中,另取147.5g KOH溶于水,再将两种溶液合并,用1N NaOH将pH调至6.7,并用水稀至1L。
  • 苯酚钠溶液:称取5g苯酚溶于少量乙醇中,加2mL甲醇和18.5mL丙酮,然后用乙醇稀释至100mL(A液),保存在冰箱中。称取27g NaOH溶于100mL水中(B液),保存在冰箱中。使用前,取A、B两液各20mL混合,并用蒸馏水稀释至100mL备用。
  • 次氯酸钠溶液100mL:取10%的次氯酸钠溶液9mL,用水稀释定容于100mL容量瓶中,即活性氯的浓度为9%,溶液稳定。
  • 10%尿素溶液500mL:取50g尿素,用水稀释至500mL。
  • 甲苯。
  • 氮的标准溶液1L:精确称取4717g硫酸铵溶于水并稀释至1L,则得含氮0.1mg/mL的标准液。再稀释10倍得到N工作液。
  1. 操作步骤

(1)标准曲线绘制:分别取氮的工作液1、3、5、7、9、11、13mL于50 mL比色管中,另取一管做空白对照。用蒸馏水加至20mL。再加4.0mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液,随加随摇匀。20min后显色,定容。1h内在分光光度计上于波长578nm处进行比色。根据光密度值与溶液浓度绘制标准曲线。

(2)土壤脲酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,加入1.0mL 甲苯。15min后加10mL10%尿素液和20mLpH6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀后在37℃恒温箱中培养24h。到时取出,6000rpm离心10min。取3.0mL上清液(新鲜土样所吸取的上清液体积为2.0mL;风干土及保存1个月的土样所吸取的上清液体积为0.5mL)于50mL刻度试管中,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

  1. 结果计算

脲酶活性以24h后1g土壤中NH3—N的毫克数表示。

NH3—N(mg)= a×b

式中 a—从标准曲线查得的NH3—N浓度,mg/mL;

b—换算成1g土的系数。

三、蛋白酶:茚三酮比色法

  1. 试剂配制

(1) 1%酪素溶液1000mL:取10g酪素,用1000mL pH7.4的0.2M磷酸盐缓冲液稀释定容至1L的容量瓶中。

(2) 0.1N硫酸。

(3) 20%硫酸钠500mL:取100g硫酸钠加水,加热溶解,冷却后稀释至500mL。

(4) 2%茚三酮液:2g茚三酮溶于100mL丙酮。

(5) 甲苯。

(6) 甘氨酸标准溶液:取0.1g甘氨酸溶于水中,定容1L,则得到含氨基氮0.02mg/mL的标准溶液。

  1. 操作步骤

(1)标准曲线绘制:分别取甘氨酸标准溶液1,3,5,7,9,11 mL于50 mL比色管中,另取一管做空白对照。加入1mL茚三酮,冲洗试管内壁后在沸水浴上加热10min,将获得的着色溶液用蒸馏水稀释至50ml。在分光光度计上于波长500nm处进行比色。以光密度为纵坐标,以氨基氮浓度为横坐标,绘制标准曲线。

(2)土壤蛋白酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,加入20mL1%的酪素和1mL 的甲苯,小心振荡后用棉塞塞紧,在30℃恒温箱中放置24h。到时取出,于混合物中加入2mL0.1N硫酸和12mL20%的硫酸钠液,以沉淀蛋白质,然后6000rpm离心15min。取上清液2.0mL滤液(新鲜土样所吸取的滤液体积为1.0mL;风干土及保存1个月的土样所吸取的滤液体积为2.0mL)于50mL比色管中,然后按绘制标准曲线显色方法进行比色测定。

每个土样均要做无基质对照,以除掉土壤原来含有的氨基氮而引起的误差。整个实验要做无土壤对照。

  1. 结果计算

蛋白酶活性,以24h后1g土壤中的氨基氮的毫克数表示。

NH2-N(mg)= (a-b)×c

式中? a—从标准曲线查得的样品(加了基质)对应的氨基氮浓度,mg/mL;

b—从标准曲线查得的样品对照组的氨基氮浓度,mg/mL;

c —换算成1g土的系数。

四、碱性磷酸酶: 磷酸苯二钠比色法

  1. 试剂配制
  • 8氯化铵―氢氧化铵缓冲液100mL:取20g纯氯化铵,溶于100mL浓氢氧化铵中。
  • 8%铁氰化钾液100mL:取8g铁氰化钾,溶于蒸馏水中,稀释至100mL(此液只能用一周)。
  • 2% 4-氨基氨替比林液100mL:取2g 4-氨基氨替比林溶于水中,稀释至100mL(此液只能用一周)。
  • 5%磷酸苯二钠溶液500mL:取2.5g磷酸苯二钠溶于水中,稀释至500mL。
  • 酚的标准溶液:

酚原液:取1g重蒸酚溶于蒸馏水中,稀释至1L,贮于棕色瓶中。

酚工作液:取10mL酚原液稀释至1L(每mL含0.01mg酚)。

  • 甲苯。
  1. 操作步骤

(1)标准曲线绘制:取1,3,5,7,9,11,13mL酚工作液置于50mL比色管中,另取一管做空白对照,分别加入20mL蒸馏水。再加入0.25mL缓冲液、0.5mL 4-氨基氨替比林液,0.5mL铁氰化钾液。每次加入试剂要充分摇动,最后定容至50mL。在15min内,在分光光度计上于510nm处比色测定溶液的光密度。最后绘成标准曲线。

(2)土壤磷酸酶活性测定:称5.00g土样,置于50mL三角瓶中,加5滴甲苯后再加入20mL0.5%磷酸苯二钠,充分振荡后于37℃恒温箱中培养2h。取培养后的滤液5mL,按标准曲线所述方法显色,比色测定。

土壤样品酶活性测定分三次进行:新鲜土样测量一次,风干后测量一次,风干土样保存1个月后再测量一次。

  1. 结果计算

磷酸酶活性,以2h后100g土壤中P2O5的毫克数表示。

P2O5(mg)= a×80×0.32×2.29

式中? a—-从标准曲线查的酚的mg数;

80—-换算成100g土壤的系数;

0.32—–以磷为单位表示结果的系数(在磷酸苯二钠中,1个重量单位的酚,相当于0.32重量单位的磷);

2.29—–将P换算成?P2O5的系数。

五、过氧化氢酶

  1. 试剂配制
  • 3%过氧化氢溶液100mL:取1mL30%的过氧化氢溶液,在100mL容量瓶中定溶至100mL即可。
  • 3N硫酸。
  • 1N高锰酸钾溶液500mL:取7.9015g高锰酸钾溶于蒸馏水中,稀释至500mL,即得0.1N的高锰酸钾溶液。
  1. 操作步骤

取2g土壤样品,置于100mL三角瓶中,并注入40mL蒸馏水和5mL0.3%过氧化氢溶液。将三角瓶放在摇床上,振荡20min。而后加入5mL 3N硫酸,以稳定未分解的过氧化氢。再将瓶中悬液用慢速滤纸过滤。然后,吸取25mL滤液,用0.1N高锰酸钾溶液滴定至淡粉红色终点,所消耗的高锰酸钾量(mL数)记为B;另取一管不加土样作对照,按上述方法操作,即滴定25mL原始的过氧化氢混合液,所消耗的高锰酸钾量(mL数)记为A。

  1. 结果计算

以20min 后1g土壤的0.1N高锰酸钾滴定的毫升数表示过氧化氢酶活

性。即A-B为过氧化氢酶活性。单位:mg KMnO4·g-1·min-1

六、碳酸酐酶

  1. 试剂配制
  • 巴比妥-KOH缓冲液500mL,称取8419g巴比妥,用近500mL的蒸

馏水溶解,用稀KOH溶液调节pH至8.3,定溶。

  • 冰块。
  • 饱和二氧化碳水:用锥形瓶装入200mL左右的蒸馏水,锥形瓶放在冰水中冰浴,冲入二氧化碳气体30min,使蒸馏水中二氧化碳饱和。
  1. 操作步骤

将每个新鲜土壤样本准确称取三份,每份1.0g,分别加入5ml 巴比妥-KOH缓冲液,混匀,装在7ml离心管,7000rpm离心10min,取上清液,分成两份,其中一份煮沸作对照。

取1ml待测液与10ml巴比妥-KOH缓冲液于反应室,搅拌。将pH计置反应液中,记下起始pH;加入9ml冰冻的二氧化碳饱和水溶液,同时用秒表计时,至pH下降一个单位(如8.30-7.30)停止计时,记下反应时间。然后,用同一土样的煮沸液做对照(所有试剂均密封置于冰浴中)。

  1. 结果计算

酶活(u)=10×(To/ Te-1)

式中,To—–灭活后的反应时间;

Te—–酶液的反应时间。

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附送这次贵州之旅的美图

4

黄果树瀑布

2

装土用的离心管

离心管们

用过的离心管们

实验室图片

烟字没亮呵呵

以上

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