生物信息学
植物营养学术交流

SDS-PAGE 教程

试剂配制:

A液(100ml):29.2%丙烯酰胺 29.2g,0.8%甲叉双丙烯酰胺 0.8g(丙烯酰胺具有神经毒性,在配制使用A液时应避免皮肤接触)现配现用. 或者直接用30%的37.5:1的混合液.

B液(100ml):1.5M Tris-HCl (pH8.8) 18.17g, 0.4%SDS 0.4g

C液(100ml):0.5M Tris-HCl (pH6.8) 6.06g, 0.4%SDS 0.4g

D液(1ml):10%过硫酸铵(APS)(催化剂)0.1g 现配现用

E液(1000ml)(5×电极缓冲液):900ml水中加入94g甘氨酸,15.1gTris,然后加入50ml的10%SDS 5g,去离子水补至1000ml

TEMED (四甲基二乙胺)(催化促进剂)

染色液:(100ml) 0.25%考马斯亮蓝 0.25g,50%甲醇 50ml,10%冰醋酸 10ml

脱色液:(500ml)10%冰醋酸 50ml,30%甲醇 150ml

实验步骤:

操作视频链接:

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本实验使用凝胶:分离胶浓度12%,浓缩胶浓度4%;(土壤蛋白浓缩胶可以考虑5%,80v跑浓缩胶,150v跑分离胶)

  1. 清洗制胶玻璃板,干燥后将两块玻璃板在电泳槽上装好,插入电泳梳子,在距离梳子下端约1cm处做一标记,取出梳子;
  2. 烧杯中配制12ml的12%分离胶:4.8ml A液,3.0 ml B液,4.12ml水,67.5μl D液,12μlTEMED;
  3. 混匀后灌入胶板至标记处,取适量水封口;
  4. 待分离胶凝固后,去除胶上面的水分,用滤纸吸干,注意不要碰到胶面;
  5. 配制6ml浓缩胶:0.81ml A液,1.5 ml C液,3.65 ml水,31μl D液,9μlTEMED;
  6. 灌入浓缩胶,插入梳子;
  7. 待浓缩胶凝固后,安装胶板,倒入电泳缓冲液;
  8. 将处理好的样品取10-30μl加入到样品孔中,加入loading buffer(上样量的1/3,15ul样品加入5ul buffer),加入5ul marker,接通电源,先在120v下电泳直至所有样品进入分离胶,然后调整电流至90v继续电泳;
  9. 待溴酚蓝前沿距胶底1cm左右时停止电泳(分子量大的蛋白可以电泳时间长一些),剥离凝胶,放入培养皿中;
  10. 在微波炉中加热10秒,加入适量染色液,振荡染色0.5h;
  11. 吸去染色液,加入脱色液振荡脱色,多次更换脱色液至条带清晰(若耗时太久可以将凝胶泡在脱色液中过夜);
  12. 待脱色理想时吸去脱色液,加入水终止反应。
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